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微生物菌種凍干操作流程

更新時(shí)間:2021-11-29      點(diǎn)擊次數(shù):1942

      

     凍干機(jī)適用于大多數(shù)細(xì)菌、放線菌、病毒、噬菌體、立克次體、霉菌和酵母等的真空冷凍干燥保藏,但不適于霉菌的菌絲型、菇類、藻類和原蟲等。其操作流程如下:


1、安瓿管準(zhǔn)備

     安瓿管材料以中性玻璃為宜。清洗安瓿管時(shí),先用2%鹽酸浸泡過夜,自來水沖洗干凈后,用蒸餾水浸泡至pH中性,干燥后、貼上標(biāo)簽,標(biāo)上菌號(hào)及時(shí)間,加入脫脂棉塞后,121℃下高壓滅菌15-20分鐘,備用。

2、保護(hù)劑的選擇和準(zhǔn)備

     保護(hù)劑種類要根據(jù)微生物類別選擇。配制保護(hù)劑時(shí),應(yīng)注意其濃度及pH值,以及滅菌方法。如血清,可用過濾滅菌;牛奶要先脫脂,用離心方法去除上層油脂,一般在100℃間歇煮沸2-3次,每次10-30分鐘,備用。

3、凍干樣品的準(zhǔn)備

     在zui適宜的培養(yǎng)條件下將細(xì)胞培養(yǎng)至靜止期或成熟期,進(jìn)行純度檢查后(參見科技部自然科技資源平臺(tái)聯(lián)合管理辦公室文件《微生物菌種純度檢測技術(shù)規(guī)程》(試行)),與保護(hù)劑混合均勻,分裝。微生物培養(yǎng)物濃度以細(xì)胞或孢子不少于108-1010個(gè)/ml為宜(以大腸桿菌為例,為了取得每毫升1010個(gè)活細(xì)胞菌液2毫升-2.5毫升,只需10毫升瓊脂斜面兩支)。采用較長的毛細(xì)滴管,直接滴入安瓿管底部,注意不要濺污上部管壁,每管分裝量約0.1-0.2毫升,若是球形安瓿管,裝量為半個(gè)球部。若是液體培養(yǎng)的微生物,應(yīng)離心去除培養(yǎng)基,然后將培養(yǎng)物與保護(hù)劑混勻,再分裝于安瓿管中。分裝安瓿管時(shí)間盡量要短,在1-2小時(shí)內(nèi)分裝完畢并預(yù)凍。分裝時(shí)應(yīng)注意在無菌條件下操作。

4、預(yù)凍

    一般預(yù)凍2小時(shí)以上,溫度達(dá)到-20℃到-35℃左右。

5、冷凍干燥

   采用冷凍干燥機(jī)進(jìn)行冷凍干燥。將冷凍后的樣品安瓿管置于冷凍干燥機(jī)的干燥箱內(nèi),開始冷凍干燥,時(shí)間一般為8-20小時(shí)。

終止干燥時(shí)間應(yīng)根據(jù)下列情況判斷:

——  安瓿管內(nèi)凍干物呈酥塊狀或松散片狀

——  真空度接近空載時(shí)的zui高值

——  樣品溫度與管外溫度接近

——  選用1-2支對(duì)照管,其水份與菌懸液同量,視為干燥完結(jié)

——  選用一個(gè)安瓿管,裝1-2%氯化鈷,如變深蘭色,可視為干燥完結(jié)

冷凍干燥完畢后,取出樣品安瓿管置于干燥器內(nèi),備用。

6、真空封口及真空檢驗(yàn)

     將安瓿管頸部用強(qiáng)火焰拉細(xì),然后采用真空泵抽真空,在真空條件下將安瓿管頸部加熱熔封。

     熔封后的干燥管可采用高頻電火花真空測定儀測定真空度。

7、保藏

     安瓿管應(yīng)低溫避光保藏。

8、質(zhì)量檢查

    冷凍干燥后抽取若干支安瓿管進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)檢查,如存活率、生產(chǎn)能力、形態(tài)變異、雜菌污染等。


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